PRACTICA 12:TARJETA CON REACTIVOS DESHIDRATADOS PARA DETECCION DE GRUPO SANGUINEO.

PRACTICA NUMERO 12

15/12/17

OBJETIVOS:

Determinacion del grupo sanguineo mediante tarjetas con reactivos deshidratados.

FUNDAMENTOS:

El test esta basado en la hemaglutinacion directa. Los anticuerpos reactivos secos presentes en la tarjeta aglutinarian los eritrocitos con los correspodientes antigenos. La falta de aglutinacion en un campo indica la ausencia del antigeno correspondiente.
El grupo sanguineo del individuo al cual se le realiza el test se determina a partir del patron de aglutinacion en la Eldon Card.

REACTIVOS:

-El campo azul anti-A contiene Ig-M monoclonal murina anti-A de la linea celular Birma-1.
-El campo anti-B contiene Ig-M monoclonal murina anti-B de la linea LB-2.
-El campo anti-D contiene Ig-M humano anti-D de la linea Ms-201.
-El campo control no contiene anticuerpos, pero si el mismmo PBS que los otros campos y un colorante azul.

MATERIALES:

-Agua destilada.
-Tarjeta ELDON DOCTOR KIT DKS 2511.
-Sangre capilar.

PROCEDIMIENTO:

-Rellenar los datos del paciente al que va ha realizar el analisis.
-Aplique una gota de agua dentro de cada area reactiva coloreada utilizando una pipeta.
-Desinfecte la zona del dedod donde va a realizar la puncion y deje secar al aire el dedo.
-Realice la puncion presionando la lanceta firmemente sobre la punta del dedo en la cara que se encuentre en direccion al dedo meñique.
-Masajee suavemente el dedo donde se realizo la puncion con el fin de obtener una gota de sangre. Recoja la gota de sangre sobre un EldonStick el cual aproximira por debajo de la gota del dedo.
-Mezclar las sangre en los circulos con la gota de agua y esperar a que el reactivo se disuelva.
-Extender la sangre por todo el circulo.
-Para desarrollar aglutinacion la tarjeta debe rotar durante unos 40 segundos.
-Los resultados se leen al momento.
-Si queremos conservar la tarjeta con los resultados, la dejamos secar sobre una superficie.

RESULTADO:

El resultado es A+, aunque el Anti-D no se puede apreciar mucho.

PRACTICA 11: PRUEBAS CRUZADAS

PRACTICA NUMERO 11

1/12/2017

OBJETIVOS:

El objetivo es detectar los posibles anticuerpos que se hallen fijados a la membrana de los hematíes con antiglobulina humana.

FUNDAMENTOS:

Esta prueba sirve para determinar la compatibilidad sanguínea enfrentando el suero del receptor con los hematíes del donante. (Prueba cruzada mayor).

APARATAJE:

-Centrifuga.

MATERIALES:

• Pipetas
• Centrifuga
• Tubos de ensayo y gradilla
• Vaso precipitado

REACTIVOS:

• Antiglobulina humana
• Suspensión de hematíes (donante)
• Suero (receptor)
• Solución salina fisiológica
• Albúmina

PROCEDIMIENTOS:

-En el primer tubo (tubo salino) añadimos 2 gotas de suspensión de hematíes al 2% y 2 gotas del suero e incubamos a tª ambiente durante 30 minutos.
-En el segundo tubo (tubo proteico) añadimos 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%, 2 gotas del suero y 2 gotas de albúmina e incubamos a 37 ºC durante 30 minutos.

-Transcurrido el tiempo centrifugamos los dos tubos a 1000 rpm durante 1 minuto.

-Si en el primer tubo (salino) hay aglutinación es que las dos muestras son incompatibles y si no existe aglutinación son compatibles.

-Si en el tubo proteico existe aglutinación la muestra no es compatible, pero si no existe aglutinación hay que confirmarlo, para ello:

-Lavamos 3 veces con solución salina y a continuación añadimos 2 gotas de antiglobulina (Coombs).

-Centrifugamos 1000 rpm durante 1 minuto y vemos el resultado.

 

-Si existe aglutinación las dos muestras son incompatibles y si no existe aglutinación son compatibles.

RESULTADOS:

Resuspendemos el botón hemático después de centrifugar y observamos la aglutinación.

Tubo salino después de centrifugar

Tubo proteico después de añadir el Coombs y centrifugar

Como se observa en la imagen no existe aglutinación en ningún tubo (los dos estaban iguales), lo que quiere decir las dos muestras son compatibles.

OBSERVACIONES:

Pueden transfundirse sangre.

PRACTICA 10: ESCRUTINIO DE ANTICUERPOS IRREGULARES.

PRACTICA NUMERO 10

27/11/17

OBJETIVOS:

Detectar la presencia de anticuerpos irregulares mediante las pruebas de salino inmediato y proteico inmediato.

UTILIDAD CLINICA:

El objetivo de esta práctica es enfrentar un suero problema con hematíes test de fenotipo conocido con objeto de detectar la presencia de anticuerpos en el suero, de los cuales se conocen con exactitud los antígenos presentes en su membrana, y aplicando técnicas de aglutinación salina y test de Coombs indirecto determinaremos dichos anticuerpos.

De este modo se detectan anticuerpos completos Ig M e incompletos Ig G.

FUNDAMENTOS:

Los anticuerpos irregulares o aglutininas irregulares son anticuerpos anti glóbulos rojos. Están presentes en algunas personas que no tienen el antígeno correspondiente en la superficie de sus glóbulos rojos. Una persona Rh negativa no debería tener efectos anticuerpos anti-Rh. Su presencia es posible después de recibir una transfusión o después de dar a luz a un hijo Rh positivo. Su búsqueda es sistemática en el caso de transfusión de sangre y en mujeres embarazadas Rh- negativas para poder detectar una incompatibilidad materno fetal.

APARATAJE:

Centrifugadora:

Baño maria:

MATERIALES:

-Tubos de hemolisis.

-Pipetas automaticas y puntas de pipeta.

-Suspension de hematies al 2 %.

-Suero del paciente.

REACTIVOS:

-Albumina.

PROCEDIMIENTO

-Añadimos a un tubo 2 gotas de suero problema + 2 gotas de los hematíes test. (Salino inmediato). Luego, incubamos a tª ambiente durante 30 minutos, mezclamos y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minutos.
-Añadimos a otro tubo 2 gotas del suero problema + 2 gotas de hematíes test + 2 gotas de albúmina. (Proteico inmediato). Luego, incubamos a 37 ºC durante 30 minutos, mezclamos y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minutos.

-Observamos la presencia de aglutinación en los tubos. La presencia de aglutinación indica un resultado positivo y el suero posee anticuerpos irregulares.

-Si en los tubos no se observa aglutinación hacemos un Coombs para detectar la presencia de anticuerpos. Para ello añadimos 2 gotas de antiglobulina y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.

-Si observamos la presencia de aglutinación al realizar el Coombs, es un resultado positivo y significa que poseemos anticuerpos irregulares. En caso negativo nuestro suero problema no posee anticuerpos irregulares.

RESULTADOS:

Nuestro resultado ha sido negativo, es decir, al resuspender el botón hemático no hemos observado aglutinación alguna, por lo que el suero problema no posee anticuerpos irregulares..

PRACTICA 9: DETERMINACION DEL FENOTIPO Y GENOTIPO MAS PROBABLE DEL GRUPO RH.

PRACTICA NUMERO 9

24/11/17

OBJETIVOS:

Investigar el genotipo mas probable del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos sueros que contienen anticuerpos dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

UTILIDAD CLINICA:

FUNDAMENTOS:

APARATAJE:

Centrifuga:

MATERIALES:

-Material para lavado de hematies.

-Tubos de hemolisis.

-Pipetas pasteur y papel parafilm.

REACTIVOS:

-Anti-D

-Anti-C

-Anti-c

-Anti-E

-Anti-e

-Autocontrol D.

-SSF.

PROCEDIMIENTO:

-Realizar el lavado de hematíes de la muestra problema y una dilucion al 5% en SF.

-Rotular los 6 tubos con las letras C,D,c,E,e y CD.

-Depositar 2 gotas del anti-suero correspondiente y dos gotas de suspensión de hematíes problema.

-Tapar los tubos con parafilm y agitar.

-Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.

-Resuspender el sedimento de los hematíes dando pequeños golpes en el fondo del tubo.

-Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

RESULTADOS:

PRACTICA 8: DIACLON ABO/D + REVERSE GROUPING.

PRACTICA NUMERO  8

22/11/17

OBJETIVOS:

Determinación de los grupos sanguíneos ABO/RH combinado con la prueba inversa o grupo serico.

UTILIDAD CLÍNICA:

La tarjeta ID-Card permite determinar el grupo hematico y el grupo serico para ABO, así como la determinación del antígeno RhD.

FUNDAMENTOS:

Los antígenos anti-A y anti-B son necesarios para determinar la presencia o ausencia de los antígenos A/B en hematíes humanos.

La determinación de los grupos sanguíneos ABO requiere la realización de una contraprueba serologica o grupo inverso con plasma o suero para confirmar los resultados obtenidos en la prueba hematica.

APARATAJE:

Centrifuga de tarjetas:

MATERIALES:

-Muestra de sangre recien extraida.

-Tubos de hemolisis.

-Micropipetas y puntas de pipeta.

-SSF.

REACTIVOS:

-Tarjeta ID-Card DiaClon ABO/D + Reverse grouping.

-Diacel A1 y Diacel B.

PROCEDIMIENTOS:

-Para la determinación del grupo ABO, se debe preparar una suspensión de hematíes al 5% de la siguiente manera:

1.Pipetear 0.5 ml de ID-Diluent 2 en un tubo.

2.Agregar 25 microlitros de concentrado de hematíes y mezclar.

-Se identifica la tarjeta con el nombre del donante o paciente.

-Se retira la lamina de sellado solo de los microtubos que se vayan a utilizar.

-Se pipetea 10 microlitros de suspensión de hematíes en los tubos A, B, D, C.

-Se pipetea 50 microlitros de plasma en los tubos A1 y B.(Sericos)

-Se pipetea 50 microlitros de Diacel 1 en el tubo A1 y 50 microlitros de Diacel 2 en el tubo B (Séricos).

-Sellar la tarjeta y centrifugar durante 10 minutos.

RESULTADOS:

El resultado es B+.

OBSERVACIONES:

PRACTICA 7: GRUPO SÉRICO.

PRACTICA NUMERO 7

17/11/17

OBJETIVOS:

Determinar el grupo sanguíneo mediante la técnica del grupo sérico.

UTILIDAD CLÍNICA:

Por determinacion inversa se realiza el grupo serico, se usan hematies reactivos A y B para establecer la presencia o ausencia de anticuerpos Anti-A y Anti-B en el suero.

FUNDAMENTOS:

APARATAJE:

-Baño Maria

MATERIALES:

-Tubos de hemolisis de 3 ml.

-Suero.

REACTIVOS:

-Suspension de hematies al 2 % A1
-Suspensión de hematíes al 2% B.

PROCEDIMIENTO:

-Se introduce en el baño maría el suero para inactivarlo a 56ºC durante 30 minutos.

-Se rotulan dos dos tubos, uno con A1 y otro con B.

-A cada tubo se le añade dos gotas de suero inactivado.

-A continuación al tubo A1 con el suero se le añade suspensión de hematíes al 2% A1.

-Y al tubo B con el suero se le añade suspensión de hematíes al 2% B.

-Por ultimo, se centrifuga 1 o 2 minutos a 1000rpm.

-Cuando se haya centrifugado, agitar el tubo y determinar el grupo sanguíneo.

RESULTADOS:

No se observa aglutinación por lo que el grupo sanguíneo es AB.

OBSERVACIONES:

Los anticuerpos anti A y anti B sericos de la mayoría de los pacientes y donantes suelen ser demasiados debiles para aglutinar los glóbulos rojos sin centrifugacion o incubación prolongada por lo que son necesarios pruebas serologicas con métodos que detecten los anticuerpos en tubos, micro-placas o aglutinación en columna.

PRACTICA 6: DETERMINACIÓN CELULAR DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS ABO Y RH EN TUBO.

PRACTICA NUMERO 6

15/11/17

OBJETIVOS:

Determinar los grupos sanguíneos del sistema ABO, determinar el Rh ( ag D) y observar la presencia de aglutinación en el tubo.

UTILIDAD CLINICA:

FUNDAMENTOS:

APARATAJE:

Centrifuga

MATERIALES:

-Gradilla, para-film.

-Tubos de hemolisis.

-Micropipeta automática y puntas de pipeta.

-Sangre anti-coagulada.

REACTIVOS:

-SF.

-Anti-A, Anti-B, Anti-AB, Anti-D, Autocontrol RH.

PROCEDIMIENTO:

-Se realiza una suspension de hematies al 5%. Para ello se prepara para toda la clase en un vaso de precipitado 7,5 ml de sangre anticoagulada con 92,5 ml de Suero Salino. Y se reparte 6,7 ml para cada grupo.

-El tubo con los 6,7 ml de la mezcla de centrifuga.

-Una vez centrifugado se quita el sobrenadante y se le añade 1,9 ml de SF y se vuelve a lavar asi hasta 3 veces.

-Por otro lado, se rotulan 5 tubos con el nombre A, B, AB, O, CD.

-Se depositan en los tubos 4 gotas de la mezcla anteriormente centrifugada y 4 gotas del reactivo correspondiente en cada tubo.

-Esperamos 2 minutos para observar las reacciones de aglutinacion resultantes.

RESULTADOS:

Aunque no se puede apreciar muy bien en la imagen en resultado es A +.

OBSERVACIONES:

-Termostatizar los reactivos a temperatura ambiente.

-Realizar un lavado de hematíes para evitar interferencias que puedan ocasionar falsos resultados.

-En el caso de que el tubo para la determinación del AG D de resultado negativo en un primer momento, incubar durante 15 min en baño termostatizado y volver a observar la presencia o ausencia de aglutinación. Si después de esto vuelve a dar negativo, entonces se considerará Rh-.

PRACTICA 5: TIPIFICACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO.

PRACTICA NUMERO 5

13/11/17

OBJETIVOS:

Esta técnica se utiliza para determinar el grupo sanguíneo mediante la tipificacion.

UTILIDAD CLÍNICA:

Se utiliza para muchas aplicación como es determinar el grupo ABO.

También se puede utilizar para otros antígenos siempre que se disponga de sus anticuerpos complementarios.

FUNDAMENTOS:

Las técnicas de aglutinación se usa para la detección de antígenos eritrocitarios, son técnicas inmunologicas que se basan en la capacidad que tienen algunos antígenos para unirse a sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a simple vista.

Esto es posible porque las moléculas de anticuerpos tienen varios sitios de unión al anticuerpo, lo que les permite unirse a dos o mas antígenos próximos.

APARATAJE:

No necesita aparatos.

MATERIALES:

-Portaobjetos.

-Sangre anti-coagulada con EDTA.

-Puntas de pipeta.

-Tubos de hemolisis de 3 ml.

REACTIVOS:

-Reactivos Anti-A, Anti-B, Anti-AB, Anti-D, Control D.

PROCEDIMIENTO:

*Para la prueba en porta:

-Se rotulan cinco portas con:

   1-A

   2-B

   3-AB 

   4-0

   5- Control 0.

-Se les añaden los reactivos correspondientes a cada porta.

-Por ultimo se le adiciona una gota de sangre anti-coagulada a cada porta y se mezcla con una punta de pipeta.

*Para la prueba en tubo:

-Se hace exactamente igual que en porta pero con tubos.

RESULTADOS:

Se trata del grupo B-, porque ha aglutinado en el porta B y es negativo por que en el porta O no ha aglutinado.

OBSERVACIONES:

-Al porta se le aplica un suave movimiento de rotación durante un minuto para que reaccione con los reactivos y se forme la aglutinación.

PRACTICA 4: TINCION DE WRIGHT.

PRACTICA NUMERO 4

16/10/17

OBJETIVOS:

Vamos a teñir un frotis de sangre periférica con tincion de Wright.

UTILIDAD CLÍNICA:

Esta técnica se utiliza para identificar estructuras celulares.

FUNDAMENTOS:

El fundamentos es el mismo que en la tincion de May Grünwald-Giemsa, pero en este caso se usa un solo colorante que es una mezcla de eosina, azul de metileno y derivados del azul de metileno en metanol.

APARATAJE:

No se utiliza ningún aparato.

MATERIALES:

-Puente de tincion.

-Portaobjetos.

-Sangre anticoagulada.

-Pipetas pasteur.

-Agua destilada.

REACTIVOS:

-Colorante ( mezcla de eosina, azul de metileno y derivados del azul de metileno en metanol)

PROCEDIMIENTOS:

-Realizar un frotis sanguíneo.

-Colocar la extensión en un puente salino de tincion sobre un cristalizador o un fregadero.

-Cubrir la extensión con colorante de Wright sin diluir durante 5-8 minutos. El metanol fija la extensión y se inicia la tincion de las célula.

-Volcar la extensión para eliminar el colorante y escurrir.

-Cubrir la extensión con una dilucion del colorante de Wright en tampon de pH 7,2 durante unos 10-15 minutos. En esta fase se completa la tincion de las estructuras celulares.

-Volcar la extensión para eliminar el colorante, lavar con agua, escurrir y dejar secar.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

-Se deben calcular las diluciones antes de realizar la practica.

PRACTICA 3: TINCION DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA.

PRACTICA NUMERO 3

16/10/2017

OBJETIVOS:

Se va a realizar una tintion de May Grünwald-Giemsa para observar estructuras celulares.

UTILIDAD CLINICA:

La tincion de May Grünwald-Giemsa es una tincion policroma mas utilizada en hematólogia basa en la combinación de dos colorantes, que en solucion acuosa se ionizan y se combinan con los distintos componentes celulares, generando sales insolubles con diferentes matices de coloración.

-May Grünwald: es una solución de eosina y azul de metileno en metanol, que actúa como fijador.

-Giemsa: es una mezcla de eosina y derivados del azul de metileno, como el azur I y azur II.

FUNDAMENTOS:

Las tinciones policromas utilizan combinaciones de colorantes con distintas afinidades paraque las estructuras celulares se tiñan con colorantes diferentes. Se aplica sobre células muertas y es necesario una fijación previa.

APARATAJE:

No se utiliza ningun aparato.

MATERIALES:

- Sangre anticoagulada con EDTA.

-Portaobjetos.

-Pipetas Pasteur.

REACTIVOS:

-Solucion de May Grünwald.

-Solucion de Giemsa.

PROCEDIMIENTO:

-Realizar una extension con sangre anticoagulada con EDTA.

-Colocar la extension en un puente de tincion sobre un cristalizador o un fregadero.

-Cubrir la extension con solucion de May Grünwald durante dos minutos (fijacion ).

-Volcar la extension para eliminar el colorante y escurrir.

-Cubrir la extension con solucion diluida de May Grünwald durante un minuto.

-Volcar a extension para eliminar el colorante y lavar con agua destilada y escurrir.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

-Los portas deben estar debidamente desengrasados.

-Se deben calcular las diluciones antes de realizar la practica.

PRACTICA 2: TINCION DE AZUL DE CRESIL BRILLANTE PARA RETICULOCITOS.

PRACTICA NUMERO 2

6/10/2017

OBJETIVOS:

Vamos a observar los reticulocitos que son hematíes inmaduros que aun conservan algunos orgánulos celulares.

UTILIDAD CLÍNICA:

Con esta tincion los hematíes se tiñen de color verde pálido y los reticulocitos se diferencian porque en su interior se observan estructuras granulares o filamentosas de color azul.

FUNDAMENTOS:

Las tinciones supravitales son tinciones diseñadas para la observación de células vivas, por tanto no requieren una fijación previa.

En este tipo de tinciones, primero se realiza la tincion, mezclando el colorante con la sangre y después se realiza la extensión sobre un portaobjetos para poder visualizar el resultado al microscopio.

La tincion supravital mas habitual para las extensiones de sangre periférica es la tincion de azul cresil brillante para reticulocitos.

APARATAJE:

No se utiliza ningun aparato.

MATERIALES:

-Sangre periférica anticuagulada con EDTA.

-Tubos de ensayo.

-Pipetas.

-Portaobjetos.

REACTIVOS:

-Solución colorante. 

PROCEDIMIENTO:

-Introducir en un tubo de hemolisis, cantidades iguales de solución colorante y de sangre periférica anticuagulada con EDTA.

-Mezclar suavemente y cerrar el tubo con parafilm para evitar la desecación.

-Incubar cinco minutos en baño maría a 37ºC.

-Homogeneizar suavemente la mezcla.

-Depositar una gota sobre un portaobjetos limpio y realizar una extensión, que se deja secar al aire.

RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

-El portaobjetos debe estar desengrasado antes de utilizarlo.