HEMATOLOGIA

miércoles, 14 de marzo de 2018

PRACTICA 24: RECUENTO DE LEUCOCITOS Y HEMATIES.

PRACTICA NUMERO 24

02/03/2018

OBJETIVOS:

Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta.

FUNDAMENTOS:

La técnica consiste en diluir sangre anticoagulada con EDTA , en líquido de Turck y el recuento de las células mediante hemocitómetro o cámara de recuento utilizando un microscopio óptico.

Para calcular el valor total de recuento tendremos en cuenta la dilución usada , el área contada y la altura de la cámara utilizada.

APARATAJE:

Microscopio.

REACTIVOS:

Líquido de Turck (2mL ácido acético glacial,que rompe los hematíes; 1mL de violeta de genciana, que tiñe el núcleo de los leucocitos al 1% y 100 mL de agua destilada).

MATERIALES:

Tubos eppendorf
Pipetas de 20 microlitros
Cámara de Neubauer
Sangre anticoagulada o capilar
Papel de filtro

PROCEDIMIENTO:

1.Preparamos un tubo eppendorf con 0,38 ml de líquido de Turck.

2.Pipeteamos 20 μL de sangre en el tubo eppendorf. Haremos una dilución 1/200.

3.Tapamos el tubo y mezclamos suavemente .

4.Montamos la cámara,llenándola por capilaridad (sobre unos 10 μL).

5.Dejamos reposar durante 5 minutos para que sedimenten los leucocitos.

-Contar los leucocitos presentes en 16 cuadros , de los 4 cuadros grandes situados en las esquinas de la cámara.

Contaremos solo los leucocitos que se situen sobre las líneas superior y derecha.

PRACTICA 23: RESISTENCIA OSMÓTICA ERITROCITARIA.

PRACTICA NUMERO 23

19/02/2018

OBJETIVOS:

Determinar la resistencia osmótica eritrocitaria.

UTILIDAD CLINICA:

La resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) o fragilidad osmótica eritrocitaria (FOE) es una técnica realizada para el estudio de las membranopatias eritrocitarias. Debido a su forma biconcava, los eritrocitos pueden aceptar, sin producir hemolisis, una entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta el 70%.

FUNDAMENTO:

Someter a los hematies a una serie de soluciones salinas hipotonicas de concentracion creciente determinando, a continuacion, el grado de hemólisis en cada una de ellas. En condiciones normales y empleando sangre sin incubar, la hemolisis se inicia a la concentracion de NaCl de 5.5g/L y es practicamente total a la de 3g/L

Esta prueba, auqneu muy util puede verse influida por diversos factores que a aveces dificultan su interpretacion, destacando reticulocitos y la eventual coexistencia de hipocromía.

APARATAJE:

Espectrofotometrica.

REACTIVOS:

Solución madre de NaCl de 100 g/L en agua bidestilada
Soluciones de trabajo.

MATERIALES:

Muestra de sangre total anticoagulada.
-Tubos de centrífuga

PROCEDIMIENTO:

1.A partir de la solución madre preparamos las siguientes soluciones de trabajo:

-Solución 1 (1 g/L de NaCl) : 1 mL sol. madre + 99 mL de agua bidestilada

-Solución 2 (3 g/L de NaCl) : 3 mL sol. madre + 97 mL de agua destilada

-Solución 3 (4 g/L de NaCl) : 4 mL sol. madre + 96 mL de agua destilada

-Solución 4 (5 g/L de NaCl) : 5 mL sol. madre + 95 mL de agua destilada

-Solución 5 (6 g/L de NaCl) : 6 mL sol. madre + 94 mL de agua destilada

-Solución 6 (8 g/L de NaCl) : 8 mL sol. madre + 92 mL de agua destilada

-Solución 7 (10 g/L de NaCl) : 10 mL sol. madre + 90 mL de agua destilada

2. Colocamos 5 mL de cada solución en una batería de tubos de centrífuga .

3. Añadimos 25 microlitros de sangre total, agitamos y dejamos a temperatura ambiente durante 45-60 minutos.

4. A continuación centrifugamos a 3000 rpm durante 10 minutos y separamos el sobrenadante.

5. Medimos el grado de hemólisis del sobrenadante en un espectofotómetro a una longitud de onda de 540 nm, considerando el tubo con 1 g/L de NaCl como el 100% de hemólisis y el de 10 g/L de NaCl como el blanco (0% de hemólisis).

RESULTADOS:

Por último representamos en un papel milimetrado ( en excel) en abscisas los g/L de NaCl , y en ordenadas el porcentaje de hemólisis de los diferentes tubos , por interpolación se determinan cuál es la concentración de NaCl necesaria para producir una hemólisis del 50 % (H50) , siendo ese valor equivalente a la FOE

Los valores normales están comprendidos entre 3,6-4,2/L NaCl.

PRACTICA 22: CFTH

PRACTICA NUMERO 22

2/03/2018

OBJETIVO:

Reactivo saturante- precipitante de capacidad de fijación.

UTILIDAD CLÍNICA:

El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado.

El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos.

El hierro se controla, normalmente, junto con la capacidad de fijación total de hierro y nos indica la capacidad de unión sérica disponible.

Encontramos niveles altos de CFTH en la anemia ferropenica.

FUNDAMENTOS:

La transferrina sérica se satura con un exceso de Fe y el exceso no fijado se elimina por precipitación con carbonato magnesico, determinándose a continuación la cantidad total de hierro presente.

La diferencia entre la capacidad de fijación total de hierro hallada y el hierro sérico inicial nos da la capacidad de fijación de hierro no saturado o residual.

APARATAJE:

Espectrofotometrica.

REACTIVOS:

R5 ( Solucion Saturante ).
R6 ( Agente precipitante ).

MATERIALES:

Suero o plasma heparinizada.
Pipeta y puntas de pipeta.
Cubetas de espectrofotometria.
Tubos de ensayo.

PROCEDIMIENTO:

1.Pipetear en los tubos: 0.5 ml de muestra + 1 ml R5.

2.Mezclar bien e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

3.Añadir a cada tubo: 3 dosis de R6.

4.Mezclar e incubar a 10 minutos a temperatura ambiente.

5.Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm.

6.Recoger el sobrenadante y procesar como una muestra para la determinación de hierro.

RESULTADOS:

El calculo que queda es:

CFTH: 0.010 umol/L

OBSERVACIONES:

Hay que tener maximo cuidado porque los resultados se realizan junto con el protocolo del hierro para saber la determinacion de CFTH.

PRACTICA 21: HIERRO

PRACTICA NUMERO 21

16/02/2018

OBJETIVOS:

Determinación cuantitativa de hierro.

UTILIDAD CLÍNICA:

El hierro es el constituyente de un gran numero de enzimas. La mioglobinas, proteínas muscular, contiene hierro, así como el hígado.

El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxigeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa anemia ferropenica. Se encuentras niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas.

FUNDAMENTOS:

El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil. El hierro libre se reduce a ion ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma complejo coloreado.

APARATAJE:

Espectrofotometro.

REACTIVOS:

R1 ( Tampón ).
R2 ( Reductor ).
R3 ( Color ).
IRON CAL.

MATERIALES:

Pipeta y puntas de pipeta.
Cubetas de espectrofotometria.
Tubos de ensayo.

PROCEDIMIENTO:

1.Preparar el RT, disolver el tubo R2 con un frasco de R1 Tampón.

2.Pipetear en diferentes tubos de ensayo:

-Blanco reactivo: 1ml RT + 3 gotas de R3 + 200ul agua destilada.

-Patrón: 1 ml RT + 3 gotas de R3 + 200 ul de patrón.

-Blanco muestra: 1 ml RT + 200ul muestra.

-Muestra: 1 ml RT + 200 ul muestra.

3.Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC.

4.Leer las absorbancias de Patron y la muestra frente al blanco de reactivo.

RESULTADOS:

-Blanco reactivo: 0.02.

-Patrón: 0.068.

-Blanco muestra: 0.022.

-Muestra: 0.071.

*Por tanto se realiza el siguiente calculo:

Muestra-Blanco muestra-Blanco Reactivo/ (Patron -blanco reactivo) =114.2UL/dl de hierro.

OBSERVACIONES:

El color es estable como minimo 30 minutos.

PRACTICA 20: CROMATOGRAFIA

PRACTICA NUMERO 20

14/02/2018

OBJETIVOS:

Determinacion de hemoglobina mediante el intercambio ionico sin interferencia.

FUNDAMENTOS:

Después de preparar un hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aniónico. La hemoglobina A2 se eluye de forma especifica bajo estrictas condiciones de pH y fuerza ionica, cuantificándose por lectura fotométrica a 415 nm.

APARATAJE:

Fotometro.

REACTIVOS:

Reactivo 1.

MATERIALES:

Microcolumna.
Sangre total.
Pipetas y puntas de pipeta.
Tubos de ensayo.
Cubetas de espectrofotometria.

PROCEDIMIENTO:

1.Invertir la cromatografia 10 minutos para compactar la resina y luego volver a volcar para sedimentar y dejarlo reposar unos minutos para que vuelva a su estado original.

2.Compactar el disco con una punta de pipeta con cuidado y abrir la tapa inferior y dejar caer el liquido sobre un tubo de ensayo.

3.Preparar en un eppendorf 50 microlitros de sangre y 200 microlitros de reactivo 1, agitar y dejarlo a temperatura ambiente durante 15 minutos.

5.Cuando ha caido todo el conservante de la cromatografia introducir 50 microlitros de sangre hemolizada sobre el disco superior.

6.Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir 200 microlitros de reactivo 1.

7.Dejar gotear hasta que el reactivo 2 alcance el disco superior y desechar diluido.

8.Pipetear 3 ml de reactivo 1 y dejar gotear hasta que el reactivo 2 a alcanzado el disco superior y recoger diluido.

10.Agitamos el diluido y leer absorbancia a 415 nm frente a agua destilada.

11.Para preparar el patron, preparamos un tubo con 12 ml de agua destilada y 50 microlitros de hemolizador y agitar ( Se preparan dos para toda la clase).

12.Se lee abosrbancia del patron a 415 nm frente a agua destilada.

PRACTICA 19: VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR.

PRACTICA NUMERO 19

14/02/2018

OBJETIVOS:

La velocidad de sedimentación globular (VSG), eritrocitaria o eritrosedimentación, mide la precipitación o sedimento de los hematíes en un tiempo determinado.

UTILIDAD CLINICA:

Esta prueba permite detectar estados de desequilibrio físico-químico como consecuencia de alteraciones orgánicas sobre todo de tipo infeccioso e inflamatorio. Aunque hay que tener en cuenta que hay diversas causas no patológicas que pueden aumentar la VSG.

MATERIALES:

Sangre venosa anticoagulada con citrato sódico al 3’8% en proporción 4:1.
Pipetas de Westergreen.
Soporte para mantenerlas verticalmente.

PROCEDIMIENTO:

1.Agitamos el tubo con sangre anticoagulada para mezclarla bien.

2.Introducimos la pipeta a través del tapón del tubo y esperamos hasta que se llene todo el tubo de sangre, con cuidado de no introducirla con mucha fuerza.

3.Esperamos 2 horas y medimos cuando pase una hora y cuando pasen dos horas.

RESULTADOS:

Para el cálculo es necesario el índice de Katz = (VSG 1ª hora + (VSG 2ª hora/ 2)) / 2

La primera hora bajó hasta 7 mm.)

La segunda hora bajó hasta los 18 mm.

Por lo tanto:18/2 = 9

(7 + 9) / 2 = 8 –> Por lo tanto, nuestro índice de sedimentación globular es de 8 mm/h.

Los valores normales son inferiores a 15 mm/h en hombres y 20 mm/h en mujeres. Por lo tanto dicho valor se encuentra dentro de los valores normales.

PRACTICA 18: DETERMINACION DE HB EN SANGRE PERIFERICA.

PRACTICA NUMERO 18

12/02/2018

OBJETIVOS:

Realizar la determinacion de la hemoglobina mediante una tecnica colorimetrica.

UTILIDAD CLÍNICA:

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos.

Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias. Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatias, deshidratacion o estancia en lugares de gran altitud.

FUNDAMENTOS:

Consiste en la oxidación de la hemoglobina por la acción del ferrocianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina, por lo tanto la intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.

APARATAJE: