14/02/2018
OBJETIVOS:
Determinacion de hemoglobina mediante el intercambio ionico sin interferencia.
FUNDAMENTOS:
Después de preparar un hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aniónico. La hemoglobina A2 se eluye de forma especifica bajo estrictas condiciones de pH y fuerza ionica, cuantificándose por lectura fotométrica a 415 nm.
APARATAJE:
- Fotometro.
REACTIVOS:
- Reactivo 1.
MATERIALES:
- Microcolumna.
- Sangre total.
- Pipetas y puntas de pipeta.
- Tubos de ensayo.
- Cubetas de espectrofotometria.
PROCEDIMIENTO:
1.Invertir la cromatografia 10 minutos para compactar la resina y luego volver a volcar para sedimentar y dejarlo reposar unos minutos para que vuelva a su estado original.
2.Compactar el disco con una punta de pipeta con cuidado y abrir la tapa inferior y dejar caer el liquido sobre un tubo de ensayo.
3.Preparar en un eppendorf 50 microlitros de sangre y 200 microlitros de reactivo 1, agitar y dejarlo a temperatura ambiente durante 15 minutos.
5.Cuando ha caido todo el conservante de la cromatografia introducir 50 microlitros de sangre hemolizada sobre el disco superior.
6.Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir 200 microlitros de reactivo 1.
7.Dejar gotear hasta que el reactivo 2 alcance el disco superior y desechar diluido.
8.Pipetear 3 ml de reactivo 1 y dejar gotear hasta que el reactivo 2 a alcanzado el disco superior y recoger diluido.
10.Agitamos el diluido y leer absorbancia a 415 nm frente a agua destilada.
11.Para preparar el patron, preparamos un tubo con 12 ml de agua destilada y 50 microlitros de hemolizador y agitar ( Se preparan dos para toda la clase).
12.Se lee abosrbancia del patron a 415 nm frente a agua destilada.
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